石川 昌和 | Masakazu Ishikawa

まずはHisat2のインストール。バイオコンダから。 conda install hisat2 その次に、Whole genome sequenceのデータからHLAのリードのみを取り出す。この場合に気をつけねければならないのがファイル名。Inputファイルは、.1.fq.gz, .2.fq.gzという名前じゃないといけない。さらにPair-endの場合、それ以前の名前は同一でないといけない。 hisatgenotype_extract_reads.py --base genotype_genome --read-dir fastq --out-dir output 最後にMapping hisatgenotype_locus.py --base hla -1 output/190609_14-1_HLA_S17_L001_R1_001.hla.extracted.1.fq.gz -2 output/190609_14-1_HLA_S17_L001_R1_001.hla.extracted.2.fq.gz Outputは以下の通り                 hisat2 graph                         7697 reads and 4219 pairs are aligned                                 1 A*01:01:01:01 (count: 4207)                                 2 A*01:128 (count: 3941)                                 3 A*01:01:72 (count: 3925)                                 4 A*01:09:01 (count: 3925)                                 5 A*01:02 (count: 3902)                                 6 A*01:198 (count: 3898)                                 7 A*01:216 (count: 3890)        

Long readが必要なRNA-seqに有用な方法。UMIなどタグをつけたLibraryを２つにわけ、ひとつはNanoporeでLong readを読む。もう一つはIlluminaなどのShort readを読み、タグをもとにMergeしていく。 参考文献 https://www.biorxiv.org/content/biorxiv/early/2018/09/24/424945.full.pdf High-throughput targeted long-read single cell sequencing reveals the clonal and transcriptional landscape of lymphocytes

創薬の分野では、たんぱく質がターゲットになるが、mRNAのAbundanceとたんぱく質のAbundanceは必ずしも一致しない。NGSを使って、Single cell levelで、mRNAとたんぱく質を同時に解析できる手法が、CITE-seq (cellular indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing)と REAP-seq (RNA expression and protein sequencing　assay)である。 どちらも抗体にDNA barcodeをくっつけて、mRNAと一緒にLibraryとして作られる。その結果、fastqには抗体の情報も入り、そのあ細胞の表面にはどの抗体がくっついているかを解析することができる。 両者の違いは、抗体とDNAを結合させる方法である。CITE-seqの場合、抗体はStreptavidinと結合し、Biotinylated DNAが結合する。 REAP-seqの場合、アミノ化したDNAと抗体をくっつけている。

要約 新しいRNAと古いRNAを区別できるRNA-seqの手法 原理 細胞培養時に、S4U 4- チオウリジンを添加し、S4Uを取り込ませる。その後ヨードアセトアミドによりS4Uをアルキル化する。 逆転写の過程で、AではなくGが合成されるため、バイオインフォマティクス的に分離できる。